DNA-Sequenzanalyse nach Sanger

Die Suche und der Nachweis unbekannter Mutationen erfordern im Gegensatz zur zielgerichteten Diagnostik aufwändigere Verfahren, die von der Größe der zu untersuchenden Gene abhängen. Auch mit der Einführung neuer Sequenziertechnologien (Next Generation Sequencing/NGS) ist die direkte DNA-Sequenzanalyse der einzelnen codierenden Abschnitte (Exons) eines definierten Gens sowie deren angrenzende Regionen nach Amplifikation durch PCR noch der Goldstandard. 1977, etwa 35 Jahre nach der Entschlüsselung der Struktur der DNA, wurden parallel zwei Technologien entwickelt, durch die die Abfolge der DNA-Bausteine aufgeklärt werden konnte: Frederick Sanger entwickelte eine Methode, durch die neue DNA enzymatisch erzeugt wird, welche anschließend analysiert werden kann (Kettenabbruch-Synthese). Die Sequenzierung nach Maxam und Gilbert dagegen erfolgt mittels eines chemischen Abbaus der DNA. Bei der Didesoxy-Methode der Sequenzierung (Kettenabbruch-Synthese) wird neben der DNA-Polymerase und dem Nukleotid-Mix zusätzlich fluoreszenzmarkierte Stoppnukleotide (Dideoxy-Nukleotide) eingesetzt, bei deren Einbau es zu einem Abbruch der Reaktion an dieser Stelle kommt. Hierdurch entstehen fluoreszenzmarkierte Kettenabbruchprodukte unterschiedlicher Länge, die sich in einem Polyacrylamid-Gel der Größe nach auftrennen und mittels Laserlichtanregung darstellen lassen. Für dieses Verfahren wurde Frederick Sanger 1980 mit seinem 2. Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. Durch die richtige Mischung von Nukleotid-Mix und Stoppnukleotiden wird erreicht, dass die Reaktion „zufällig“ zum Stehen kommt und letztlich alle theoretisch möglichen Sequenzfragmente dargestellt werden. Da die Stoppnukleotide mit 4 unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, kann man bei der Auswertung die einzelnen Basen unterscheiden und die Abfolge anhand der Größe der Fragmente bestimmen. Das Auslesen der Rohdaten erfolgt mit Hilfe einer speziellen Software, die Feinauswertung (Editierung) durch einen erfahrenen Mitarbeiter am Computermonitor. Die DNA-Sequenzanalyse wird in der Routine zur Mutationssuche und zum Nachweis bekannter Mutationen bei monogenen Erkrankungen eingesetzt. In der Routinediagnostik kommen mehrkanalige (16/48/96) Kapillarelektrophoresegeräte zum Einsatz. Zu den wichtigsten Vorteilen der direkten DNA-Sequzenzanalyse gegenüber Screening-Verfahren gehören die Vergleichbarkeit der Daten, die auf einer weitgehend standardisierten Methode beruhen, die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Methode, die Sicherstellung der Qualität durch internationale Ringversuche und die vergleichsweise einfache Durchführbarkeit ohne aufwändige Optimierungsschritte.